细胞复苏的成败与冻存及复苏的操作密切相关。上周，我们讨论了细胞冻存流程中常见的错误，您可以参考《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》。本篇将重点分析复苏过程中的问题，帮助您确保成功复苏。

复苏步骤回顾

在详细介绍复苏常见错误之前，我们先回顾一下复苏的基本步骤：

1. 提前将水浴锅预热至37℃，并复温培养基，设置离心机的转速。
2. 准备一个15ml离心管，并加入适量培养基。
3. 从液氮中取出冻存管，迅速浸入水浴锅，并摇晃使细胞在2分钟内完全融化。
4. 将融化的细胞悬液缓慢滴入提前加了培养基的离心管中，离心设置为1000rpm，持续3分钟。
5. 弃去上清，重悬细胞并接种至培养器皿中，最后将其放入培养箱。

复苏过程中的常见错误

以下是细胞复苏过程中常见的错误操作：

1. 如果液氮或冰箱与水浴锅的距离较远，未进行保冷措施，细胞可能在运输过程中开始融化（尤其在夏季）。冻存细胞应放在干冰或冰盒上运输至水浴锅。
2. 在运输冻存管时，切勿用手触碰细胞部分或将其放在口袋里。应仅捏住管盖或将其放置于安全容器中进行运输，以避免局部温度升高。
3. 不要用手直接捂化冻存管（搓热亦不可）。手心温度不足以让细胞均匀受热，且降温过慢会导致细胞死亡。
4. 水浴期间未严格控制时间，直接静置水中而不进行晃动，会导致细胞复苏效果不佳。应遵循“快融”原则，建议在2分钟内完成细胞融化。通过捏住管盖快速摇晃以促进细胞融化，而不是静置于水浴中。
5. 若水浴结束后管内仍残留较大冰块，未完全融化的冰块会使细胞死亡。一方面，冰块中的细胞缓慢升温而死亡；另一方面，冰块会使已融化的细胞受到低温损伤。若2分钟水浴难以达到融化效果，可适当提高水浴锅温度至39度进行实验，并加快摇晃速度。担心污染的话，可以将冻存管放在一次性PE手套内再进行水浴。
6. 细胞融化后未进行离心去除DMSO。一些科研人员会在细胞融化后直接加10倍培养基稀释，而不离心直接培养，等细胞贴壁后再更换培养基。尽管对于一些好养的贴壁细胞此方法可行，但并不适用于悬浮细胞，且DMSO对细胞有一定毒性。因此，如果不确定您的细胞是否对DMSO敏感，最好进行离心以去除上清液，保障细胞的存活率。

以上总结基于多年经验，结合冻存流程的知识，可以较好地解决复苏失败的问题。如果您有其他未提及的观点或经验，请在评论区分享，携手共同探索细胞复苏的奥秘！同时，记得关注人生就是博-尊龙凯时，获取更多生物医疗方面的知识，助力您在科研道路上更进一步！