在上期，我们共同探讨了同源重组法构建质粒的实验步骤。本期，我们将重点关注实验中的注意事项。让我们一起深入了解吧！

一、同源重组法质粒构建中的注意事项

(1) 引物设计：同源臂的长度通常为15-20 bp，GC含量应保持在40%-60%之间。在计算引物的Tm值时，仅应考虑特异性引物的部分，而不包括同源臂和酶切位点。若引物长度超过40 bp，建议在引物合成时选择PAGE纯化，以提高阳性克隆率。

(2) 模板选择：在PCR扩增插入片段时，如果目的片段较难扩增，可以先使用不带同源臂的引物进行克隆，再用胶回收的产物作为模板，使用带有同源臂的引物进行二次PCR扩增，但需注意此方法可能引入较多突变。

(3) 酶切与线性化：在使用限制性内切酶进行载体线性化时，要确保酶切完全，可以通过延长酶切时间或采用双酶切方法实现。若使用单酶切方法，则需关注环状质粒的残留可能影响转化效果。

(4) 片段纯化：在胶回收过程中应使用新的刀片，以避免外源DNA污染。同时，确保胶回收产物的质量和浓度，以便精准计算后续使用量。

(5) 比例与用量：应严格按照载体与插入片段的最佳摩尔比1:2来计算和使用其量，以提高重组效率。若使用未经纯化的线性化克隆载体和插入片段扩增产物，其添加的总体积应不超过反应体系体积的1/5。

(6) 重组反应条件：重组反应体系需在冰上配置，轻轻吸打混匀以避免振荡。反应温度和时间需严格控制，通常为37℃反应30分钟，反应时间不足或过长均可能降低克隆效率。

(7) 转化过程：感受态细胞应在冰上解冻，加入重组产物后应轻轻混匀以防细胞受损。热激的时间和温度需准确把控，热激后应迅速置于冰上冷却。此外，转化产物的涂布量也应适中，过量或不足都可能影响阳性克隆的筛选。

(8) 鉴定环节：在菌落PCR鉴定时，需选择合适的引物和PCR程序，以确保鉴定结果的准确性。对于初步鉴定为阳性的菌落，建议进行测序以最终确认重组质粒的正确性。

二、同源重组法质粒构建中的常见问题

1. 胶回收产物低，浓度不足以进行连接时，可以增加实验的起始量，因大部分胶回收试剂盒的回收率仅为30%-60%。建议在载体酶切和插入片段扩增时使用200 μl的跑胶体积。

2. 扩增的PCR产物无条带或条带弱，需检查引物的Tm值及GC含量，可以更换引物或调整PCR条件以达到最佳效果。

3. 涂板后没有菌落或只有少量菌落，可能是线性化的克隆载体和插入片段扩增量不足或过量，或者比例不理想，建议使用双酶切法以防自连。

4. 菌液PCR无条带，可能是因为载体连接未成功或引物设计存在问题。

三、实验相关产品推荐

以下是推荐的相关产品：
货号：27106，产品名称：质粒小提试剂盒，品牌：QIAprep Spin Miniprep Kit，价格：详询
货号：D200596，产品名称：孔酵母质粒小提试剂盒，品牌：Zymoprep-96 Yeast Plasmid Miniprep，价格：详询
货号：TD407，产品名称：琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，品牌：简石生物，价格：详询
货号：UFC903096，产品名称：Millipore超滤离心管—30kDa，品牌：密理博，价格：详询
货号：MDX006，产品名称：高特异性高保真Pfu酶预混液，品牌：Meridian Biosciences，价格：详询

以上产品均可通过[人生就是博-尊龙凯时]进行咨询，欢迎了解更多产品和技术相关问题！

[人生就是博-尊龙凯时]致力于生物医学领域的核心试剂研发、生产与销售，依托中科院的科研力量，以客户为中心，服务全国范围的客户，提供优质的生物试剂产品。